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研究:底物浓度对反硝化MBBR处理反渗透浓水脱氮

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MBBR(moving bed biofilm reactor)是在反应器中填充密度接近于水的填料,利用填料上的生物膜和活性污泥同时去除污水中污染物的微生物处理工艺,具有高效灵活、耐冲击负荷、剩余污泥少和脱氮除磷效率高等优点[1]。近年来,反硝化MBBR被用于生活污水和海水中氮的深度去除[2,3,4]。反硝化MBBR用于处理被NO−3O3--N污染的海水时,反硝化速率达(17.7±1.4)g/(m2·d)[3];用于处理生活污水时,TN去除率可达94%[5]。前置和后置反硝化MBBR在用于污水处理厂的深度处理时,TN去除率可达90%[2]。苑泉等[6]在进水TN浓度为9.7 mg/L时,用反硝化MBBR处理二沉池出水,TN去除率达到50%。反硝化MBBR运行过程中会受到包括底物浓度、温度、碳氮比、水力停留时间(HRT)和填料类型等因素的影响,进水中氮负荷的变化会影响反硝化脱氮效能和反硝化微生物群落结构[7]。在对垃圾渗滤液进行反硝化和厌氧氨氧化协同脱氮时,当TN负荷由15 g/(m3·d)增至25 g/(m3·d)时,TN去除率由67.7%降至60.2%[8];而在水体中TN浓度为1.21~6.50 mg/L时,反硝化细菌群落结构也会发生相应变化[9]。上述研究均表明,进水底物浓度会影响生物的脱氮效能和微生物群落结构。; b5 ~% u4 K. o% Z- M( K© 2tech.cn
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在全世界水资源匮乏日渐严重的形势下,反渗透技术(reverse osmosis,RO)因具有处理效率高、能源消耗低和占地面积小等优点[10]逐渐被用于城市污水处理厂尾水的处理和生产高品质水工艺中。但RO在生产高品质回用水的同时也会产生反渗透浓水,氮等物质会在反渗透浓水中富集。低压反渗透单元(DFRO)被用于城市污水厂出水生产高品质再生水,在该过程中DFRO产生的反渗透浓水具有TN浓度高和NOx−Ox--N(NO−3O3--N +NO−2O2--N)占比高等特点[11],亟需对NO−2O2--N、NO−3O3--N和TN进行深度去除。目前国内外应用反硝化MBBR处理的污水有城镇污水、污水处理厂尾水和海水等[12],鲜见将其用于处理高品质再生水过程中产生的反渗透浓水的研究。针对反渗透浓水TN浓度高和NOx−Ox--N占比高的问题,笔者采用反硝化MBBR处理实际反渗透浓水,研究底物浓度对其脱氮效能及脱氮相关基因的影响,考察不同底物浓度下反硝化MBBR对NO−2O2--N、NO−3O3--N和TN的去除效能,揭示反硝化基因等脱氮基因对不同底物浓度下反硝化MBBR脱氮效能的响应。
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1 材料与方法
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© 环保之家[2tech.cn]- b: `, [) l4 G( R5 m1.1 试验装置
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© 环保之家[2tech.cn]4 P( f0 c: q1 p5 j& k4 A+ m反硝化MBBR装置采用有机玻璃制成。反应器为圆柱型,内径0.25 m,高0.25 m,有效体积为12 L(图1)。其中填充本课题组研发的液相氧化-水浴接枝丙烯酸改性聚乙烯填料[13],填料性能参数见表1。 环保之家.JPG
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© 环保之家[2tech.cn]! u8 B* ]/ C% I" l- O1.2 试验设计
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取北京某污水处理厂缺氧池中的污泥接种,接种后反应器内污泥混合液悬浮固体(MLSS)浓度为3 544 mg/L,混合液挥发性固体(MLVSS)浓度为1 897 mg/L,MLVSS/MLSS为0.54。采用连续流进水方式,根据实际反渗透浓水进水中NO−3O3--N、NO−2O2--N和TN的浓度变化特征,分4个阶段(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)研究底物浓度对MBBR反硝化效能的影响。用加热棒控制温度为24~27 ℃,HRT为12 h,填料填充率为30%,采用电动搅拌器搅拌使填料和污泥保持悬浮状态。适当补充甲醇作为外加碳源,使进水COD/TIN为2.9~4.8,反应器中溶解氧浓度低于0.5 mg/L。各阶段进水水质见表2。) X  u9 W# P: j9 V+ X© 2tech.cn

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© 环保之家[2tech.cn]( ~$ \7 R' v( |( J& U7 Y% T) y; b# J1.3 水质分析方法
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© 环保之家[2tech.cn]' v2 M3 ?4 F4 F- k$ r8 }测定的水质指标、分析方法和所用仪器如表3所示。每4 d取样1次,水样经0.45 μm滤膜过滤后测定NH+4H4+-N、NO−2O2--N和NO−3O3--N浓度,静置后取上清液测定其他指标。试验中所用药品均为分析纯(国药集团化学试剂北京有限公司)。9 m$ P6 z/ X( ?; B7 R  j% f© 2tech.cn

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1.4 微生物及分子生物学分析
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在每个阶段稳定期,取适量填料和底泥进行生物量、扫描电镜(SEM)及荧光定量PCR(qPCR)测定。0 {/ g: Z' r" M$ j, C© 2tech.cn

© 环保之家[2tech.cn]. ]$ N5 o+ L2 D$ _生物量测定:取一定量各阶段稳定期的反硝化MBBR填料浸于1 mol/L的NaOH溶液中,经80 ℃水浴30 min后,100 W超声1 min,涡旋振荡30 s,测定溶液中SS浓度[6]。
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SEM观察[15]:取各阶段稳定期反硝化MBBR填料,用无菌剪剪至5 mm×5 mm的小块,用2.5%中性戊二醛固定,磷酸缓冲液清洗,乙醇梯度脱水,进行临界点干燥和喷金后,置于SEM电镜下观察。5 J/ O9 a) P' S  [© 2tech.cn
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qPCR测定:在ABI 7500型荧光定量PCR仪(Life Technologies,美国)对各阶段稳定期的填料生物膜和底泥样品进行qPCR分析,对16S rRNA基因、厌氧氨氧化细菌基因(Anammox)和反硝化中编码硝酸盐还原酶功能基因(narG)、编码cytoome cd1亚硝酸盐还原酶基因(nirK)、编码copper亚硝酸盐还原酶基因(nirS)和编码N2O还原酶基因(nosZ)的拷贝数进行定量分析,各目的基因的引物序列见表4。$ M: H3 K. }4 @( O8 D3 W9 v© 2tech.cn

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© 环保之家[2tech.cn]0 f# U" }+ S- R& F/ x用土壤基因组DNA提取试剂盒(MP Biomedicals,美国)提取生物膜和底泥样品的DNA。20 μL的qPCR混合反应物由16.4 μL的2X Taq Plus Master Mix(Vazyme Biotech,美国),2 μL的模板DNA,0.8 μL的正向引物和0.8 μL的反向引物组成。qPCR的反应条件:95 ℃预变性5 min;在不同温度下(16S rRNA基因、narG和nirS,60 ℃;nirK,54 ℃;nosZ,56 ℃;Anammox,55 ℃)变性30 s,共40个循环;最后72 ℃延伸40 s。每个样品设3个平行样。用Nano Drop 2000 分析仪(Thermo Fisher Scientific, 美国)监测构建质粒的数量与质量。以10倍梯度稀释反硝化细菌及各功能基因重组质粒进行qPCR(博日9600Plus,中国)检测,获得16S rRNA基因、Anammox及各功能基因标准曲线。R2为0.994 9~0.999 9,扩增效率为84.8%~99.7%。来源:《环境工程技术学报》  作者:李莉等/ a3 H' i; o0 T. m© 2tech.cn

© 环保之家[2tech.cn]) ~( l0 d. C' U6 m/ I2 L9 c2 结果与讨论
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© 环保之家[2tech.cn]- ~/ d: d/ H0 J$ ~2.1 底物浓度对反硝化MBBR脱氮效能的影响
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© 环保之家[2tech.cn]* I" z4 j; y7 }6 w2 k2 ^/ @- |: E! U2.1.1 底物浓度对去除NO−3O3--N的影响
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© 环保之家[2tech.cn]6 `% t2 s! ]0 `% Q$ `2.1.1.1 进水TN和NO−3O3--N浓度% K; y; u5 g0 L  R, {3 v  l3 i% h© 2tech.cn
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由表2可知,Ⅲ阶段相对于Ⅱ阶段,进水NO−2O2--N和NH+4H4+-N浓度基本未变。由图2(a)可见,进水NO−3O3--N和TN浓度分别由(8.70±6.34)和(28.43±5.69)mg/L增至(24.23±8.69)和(44.10±7.37)mg/L时,NO−3O3--N去除率分别为83.9%±4.01%和80.69%±7.46%;反硝化速率由(15.48±3.80)g/(m3·d)增至(44.58±3.67)g/(m3·d)。可见反应器内微生物对NO−3O3--N和TN浓度增加适应良好,对NO−3O3--N去除率影响不大,反硝化率随浓度增加而增加。在生物活性炭硫反硝化脱氮系统中,当进水NO−3O3--N浓度为10~40 mg/L时,NO−3O3--N去除率基本未变化[22],与本研究结果一致,但其NO−3O3--N去除率在93%以上,高于本研究,可能与反渗透浓水水质复杂有关。: n# J! r: B8 N' w& ]( _, A© 2tech.cn
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用土壤基因组DNA提取试剂盒(MP Biomedicals,美国)提取生物膜和底泥样品的DNA。20 μL的qPCR混合反应物由16.4 μL的2X Taq Plus Master Mix(Vazyme Biotech,美国),2 μL的模板DNA,0.8 μL的正向引物和0.8 μL的反向引物组成。qPCR的反应条件:95 ℃预变性5 min;在不同温度下(16S rRNA基因、narG和nirS,60 ℃;nirK,54 ℃;nosZ,56 ℃;Anammox,55 ℃)变性30 s,共40个循环;最后72 ℃延伸40 s。每个样品设3个平行样。用Nano Drop 2000 分析仪(Thermo Fisher Scientific, 美国)监测构建质粒的数量与质量。以10倍梯度稀释反硝化细菌及各功能基因重组质粒进行qPCR(博日9600Plus,中国)检测,获得16S rRNA基因、Anammox及各功能基因标准曲线。R2为0.994 9~0.999 9,扩增效率为84.8%~99.7%。8 V3 i3 C+ ~# k© 2tech.cn

© 环保之家[2tech.cn]- t% `  w1 A& I: M3 c, e8 u) f2.1.1.2 进水NO−2O2--N浓度9 n* O$ ]# R$ q8 y2 W. t- T! q3 @© 2tech.cn
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由表2可知,Ⅱ阶段相对于Ⅰ阶段,进水TN浓度基本未变,但由图2(b)可见,NO−3O3--N浓度减少6.20 mg/L,NO−2O2--N浓度增加10.00 mg/L;Ⅲ阶段相对于Ⅳ阶段,进水TN浓度基本未变,NO−3O3--N浓度减少5.62 mg/L,NO−2O2--N浓度增加6.45 mg/L。由2.1.1.1节可知,进水NO−3O3--N浓度对NO−3O3--N去除率影响不大,因此只考虑NO−2O2--N浓度对NO−3O3--N去除的影响。7 M+ [  d0 ^9 e, X1 q© 2tech.cn
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Ⅱ阶段相对于Ⅰ阶段,NO−3O3--N去除率降低5.86个百分点,反硝化速率降低12.19 g/(m3·d);Ⅲ阶段相对于Ⅳ阶段,NO−3O3--N去除率降低4.52个百分点,反硝化速率降低8.21 g/( m3·d)。由以上分析可知,随着NO−2O2--N浓度的增加,NO−3O3--N去除率和反硝化速率均下降。王少坡等[23]报道在进水(NO−3O3--N+ NO−2O2--N)浓度一定时,NO−2O2--N占比越高,反硝化结束时反应器内pH越高;而反应器内pH升高可能会超出反硝化最适pH,从而降低NO−3O3--N去除率和反硝化速率[24]。王亚宜等[25]研究发现,当NO−2O2--N浓度由5.5 mg/L增至15.0 mg/L时,序批式活性污泥反应器反硝化速率降低。
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2.1.2 底物浓度对去除NO−2O2--N的影响
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2.1.2.1 进水TN和NO−3O3--N浓度, G  o- x% _/ P8 x  x3 F: K& [! i© 2tech.cn
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由图3可见,Ⅲ阶段于相对于Ⅱ阶段,NO−2O2--N去除率由86.55%±3.73%降至76.46%±6.69%;同时NO−2O2--N去除速率也由(42.66±5.46)g/(m3·d)降至(31.81±2.66)g/(m3·d)。可见随着TN和NO−3O3--N浓度增加,NO−2O2--N去除率和去除速率均下降。可能是因为在反硝化过程中,每消耗1 g NO−3O3--N或NO−2O2--N产生3.57 g碱度(以CaCO3计),反硝化过程可导致反应器内pH升到9以上,且进水NO−3O3--N浓度越高,产生的碱度越高[26]。有报道指出,当pH为9.2时,控制NO−2O2--N还原的nirK基因活性受到抑制,NO−2O2--N形成积累[27]。由2.1.1.1节可知,Ⅲ阶段与Ⅱ阶段相比,反硝化速率增加,产生的碱度高,造成的NO−2O2--N积累率高,因此NO−2O2--N去除率和去除速率均下降。
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© 环保之家[2tech.cn]! K3 I$ H9 u9 W$ \; u由图3可见,Ⅱ阶段相对于Ⅰ阶段,NO−2O2--N去除率由69.07%±5.63%增至86.55%±3.73%,NO−2O2--N去除速率也由(13.81±2.85)g/(m3·d)增至(42.66±5.46)g/(m3·d)。Ⅲ阶段相对于Ⅳ阶段,NO−2O2--N去除率增加1.68个百分点,NO−2O2--N去除速率也由(18.21±2.42)g/(m3·d)增至(31.81±2.66)g/(m3·d)。由此可知,随着NO−2O2--N浓度的升高,NO−2O2--N去除率和去除速率增加。一方面,NO−2O2--N增多有利于厌氧氨氧化反应的进行[28]。另一方面,有报道称,当NO−2O2--N浓度小于30 mg/L时,随着浓度的升不高,反硝化电子受体增加,NO−2O2--N去除速率随之增加,但当进水NO−2O2--N浓度大于40 mg/L时,随着浓度的升高,反硝化速率下降[29]。
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© 环保之家[2tech.cn]: x9 l5 @9 s7 [: R3 z# l- A2.1.3 底物浓度对去除TN的影响# O9 n& U0 Z# d2 T© 2tech.cn
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2.1.3.1 进水TN和NO−3O3--N浓度. k% i* X* o% O3 s8 r; x© 2tech.cn

© 环保之家[2tech.cn]$ p6 y5 H& p0 x: w由图4(a)可见,Ⅲ阶段和Ⅱ阶段的TN去除率分别为78.47%±8.65%和76.95%±9.40%,变化不大;但TN去除速率由Ⅱ阶段的(50.19±7.19)g/(m3·d)增至Ⅲ阶段的(69.08±10)g/(m3·d)。可见NO−3O3--N和TN浓度的增加,对TN去除率影响不大,TN去除速率随浓度增加有所增加,反应器内微生物对NO−3O3--N和TN浓度增加适应良好。王亚宜等[30]发现,初始NO−3O3--N浓度越高,反硝化速率越快;反硝化速率越大,TN去除率也越高[22]。
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2.1.3.2 进水NO−2O2--N浓度9 c  U. ?, a5 a8 n1 u% I/ P© 2tech.cn
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由2.1.3.1节可知,进水NO−3O3--N浓度对TN去除率影响不大,因此只考虑NO−2O2--N浓度对去除TN的影响。由图4(b)可见,Ⅱ阶段相对于Ⅰ阶段,TN去除率和去除速率分别降低3.15个百分点和1.15 g/(m3·d);Ⅲ阶段相对于Ⅳ阶段,TN去除率和去除速率分别降低5.88个百分点和4.07 g/(m3·d)。由此可知,随着NO−2O2--N浓度的升高TN去除率和反硝化速率均稍有下降,这可能是因为进水NO−2O2--N浓度对反硝化微生物具有抑制作用,随着NO−2O2--N浓度增加,抑制作用增强,硝酸还原菌等脱氮菌的活性降低所致。+ a8 W4 \  L: \" l0 u2 i& u- E© 2tech.cn
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精彩评论1

 楼主| 中国环保  莫问四书意  发表于 2021-4-17 16:48:46 | 显示全部楼层
2.2 底物浓度对反硝化MBBR微生物群落影响
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2.2.1 生物量变化+ o2 y: `) Z5 j9 Z4 C© 2tech.cn

© 环保之家[2tech.cn]; e9 g5 j% F4 J; t4 [2 s% GⅢ阶段填料生物量(7.29 mg/g)与Ⅱ阶段(16.06 mg/g)相比,减少了8.77 mg/g。结合2.1节可知,Ⅲ阶段与Ⅱ阶段相比,NO−3O3--N和TN去除率高,NO−2O2--N去除率低。有报道指出,MBBR填料生物量越大处理负荷不一定越高[12],也可能是Ⅲ阶段生物膜中的有效细菌较多,同时其底泥中生物量也多。
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Ⅱ阶段填料生物量(16.06 mg/g)与Ⅰ阶段(16.34 mg/g)相比,稍有下降;Ⅲ阶段填料生物量(7.29 mg/g)远低于Ⅳ阶段(25.94 mg/g)。这与4个阶段各种氮物质去除率变化一致。
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2.2.2 填料表面生物膜形态观察; ]9 S( C. u9 j5 F) Q- {© 2tech.cn

© 环保之家[2tech.cn]% D  v1 _6 ^) r- q0 ?对稳定期的填料表面进行SEM扫描,观察其表面挂膜情况和微生物组成,结果如图5所示。由图5可见,Ⅰ阶段和Ⅱ阶段填料表面生物膜致密,主要为丝状菌、球菌和杆菌,并且球菌较多,杆菌和丝状菌相对较少。Ⅲ阶段的生物膜较稀薄,主要以杆菌和丝状菌为主,球菌较少。而在Ⅳ阶段,生物膜相较Ⅰ~Ⅲ阶段更为均匀密实,且球菌的比例增多。球菌可能为反硝化细菌中的微球菌属,而典型的反硝化假单胞菌属和色杆菌属均呈杆状[31]。6 f2 ]# ?; p! ?* s) R: I© 2tech.cn
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2.2.3 生物膜和底泥中脱氮基因拷贝数变化
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© 环保之家[2tech.cn]. |$ N% l" h! y. a, m用qPCR测定各阶段稳定期的生物膜和底泥样品中基因拷贝数,结果如图6所示。由图6可见,Ⅲ阶段生物膜样品中16S rRNA 基因、narG、nirK、nirS、nosZ和Anammox基因拷贝数分别为(7.7×1010±5.3×109)、(3.2×107±1.5×106)、(1.7×108±8.3×106)、(1.4×1010±6.1×108)、(1.1×107±3.2×106)和(3.0×106±4.9×105)个/g,除nirK、nirS和Anammox基因外,均高于Ⅱ阶段;Ⅲ阶段底泥样品中除nirK和Anammox基因外也均高于Ⅱ阶段。各脱氮基因拷贝数随底物浓度增加而增大,因此TN和NO−3O3--N去除率变化不大,但二者的去除速率随浓度增加而增大。反硝化过程包括4个连续的步骤,其中nirS和nirK基因驱动将NO−2O2-逐步还原为NO,并在其他基因作用下最终还原为N2,是NO−2O2-转化的关键基因,也是研究最为广泛的基因[32],Anammox基因是典型厌氧氨氧化基因(与NO−2O2-去除密切相关)[33]。Ⅲ阶段相比于Ⅱ阶段上述基因拷贝数的降低也与NO−2O2--N去除率和去除速率下降一致。
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© 环保之家[2tech.cn]8 i% j$ m# @4 Y0 c1 ~3 y) `5 [Fig.6The copy numbers of genes in carrier biofilm and activated sludge of four stages
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© 环保之家[2tech.cn]$ ]2 d* H( k8 ~& P+ h8 DⅡ阶段生物膜样品中16S rRNA、narG、nirK、nirS和nosZ和Anammox基因拷贝数分别为(5.9×1010±4.6×109)、(1.3×107±1.1×106)、(4.0×108±3.7×107)、(1.7×1010±5.4×108)、(6.1×106±4.9×105)和(1.5×107±3.2×106)个/g,除narG基因外,均高于Ⅰ阶段;Ⅱ阶段底泥样品中所有基因拷贝数均高于Ⅰ阶段;并且Ⅱ阶段的Anammox基因拷贝数明显高于Ⅰ阶段,这与Ⅱ阶段NO−2O2--N去除率和去除速率高于Ⅰ阶段相一致;但Ⅱ阶段NO−3O3--N和TN去除率和去除速率稍低于Ⅰ阶段,可能与Ⅱ阶段中narG基因拷贝数较低有关。: Y1 Y5 B$ ?$ W8 C2 l6 _- x* P5 z© 2tech.cn
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Ⅲ阶段生物膜样品中,除16S rRNA基因和Anammox基因外,反硝化narG、nirK、nirS和nosZ基因拷贝数均低于Ⅳ阶段,这也与Ⅲ阶段与Ⅳ阶段相比NO−3O3--N和TN去除率和去除速率均降低一致;在nirS基因拷贝数基本接近的情况下,Ⅲ阶段的Anammox基因拷贝数明显高于Ⅳ阶段,这有利于厌氧氨氧化的发生和NO−2O2--N的去除[5],因此Ⅲ阶段与Ⅳ阶段相比,NO−2O2--N去除率和去除速率增加。7 k, e  b! `* \  r- k! ?" v& P" |; a© 2tech.cn
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此外,NO−2O2--N还原酶的编码基因中,4个阶段的nirS基因拷贝数均比nirK基因拷贝数高1~2个数量级,这与其他生物系统的脱氮基因研究结果相一致[34,35,36]。相关报道指出,nirK基因比nirS基因对于厌氧环境的要求更高[37],导致nirK基因拷贝数较低;且nirS基因在已研究过的反硝化细菌中分布更广,而仅有30%的菌株含有nirK基因[38]。Ⅱ阶段的Anammox基因拷贝数比其他阶段高1~4个数量级,推测是由Ⅰ阶段高NO−2O2--N积累率引起,这也导致Ⅱ阶段NO−2O2--N去除率和去除速率均较高。5 l8 {# N0 x& G. ^" O/ ^7 L© 2tech.cn
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3 结论
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© 环保之家[2tech.cn]+ D4 `4 g* y2 \  W, U% w% b  B(1)在稳定期内进水中NO−3O3--N、NO−2O2--N和TN浓度分别为(8.70±6.34)~(29.85±5.27)、(10.94±8.51)~(20.94±5.78)和(26.68±11.87)~(44.10±7.37)mg/L时,反硝化MBBR对NO−3O3--N、NO−2O2--N和TN的去除率分别为(80.69%±7.46%)~(89.76%±4.02%)、(69.07%±5.63%)~(86.55%±3.73%)和(76.95%±9.4%)~(84.35%±6.18%),具有稳定的反硝化效能。
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© 环保之家[2tech.cn]8 U6 I9 h* m2 w0 }" l(2)进水NO−3O3--N浓度为(8.70±6.34)~(24.23±8.69)mg/L,TN浓度为(28.43±5.69)~(44.10±7.37)mg/L时,NO−3O3--N和TN去除率变化不大,但二者的去除速率随浓度增加而增加,NO−2O2--N去除率和去除速率下降,这与NO−3O3--N浓度越高产生的碱度越高,导致NO−2O2--N积累率较高有关。
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(3)进水NO−2O2--N浓度为(10.94±8.51)~(20.94±5.78)mg/L时,NO−3O3--N和TN去除率及去除速率均随浓度升高而下降,这可能是因为进水NO−2O2--N浓度对反硝化微生物具有抑制作用;NO−2O2--N的平均去除率及去除速率均上升,这与Anammox基因等脱氮基因拷贝数增多有关。
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(4)反硝化MBBR生物膜主要由球菌、杆菌和少量的丝状菌组成。生物膜(除nirK、nirS和Anammox基因)和底泥(除nirK和Anammox基因)中各脱氮基因拷贝数随NO−3O3--N和TN浓度增加而增大;随NO−2O2--N浓度增加,nirK、nirS和Anammox等基因拷贝数也相应增加。4个阶段的基因拷贝数变化与NO−3O3--N、NO−2O2--N和TN去除效果变化一致。
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