前沿关注 前沿：亲和性决定了氨氧化古菌和厌氧氨氧化菌间环境合作

厌氧氨氧化（Anammox）是指在厌氧或者缺氧条件下，厌氧氨氧化微生物以亚硝酸盐为电子受体，将氨氮氧化为成氮气的生物过程。据估计，全球约30%的海洋氮损失是由厌氧氨氧化造成。主导这一过程的微生物被称为厌氧氨氧化菌（AnAOB），是一类可以利用氨和亚硝酸盐进行生长的自养型微生物，广泛分布于海洋、淡水、陆地和各种极端缺氧环境。厌氧氨氧化菌(AnAOB)生长所需的亚硝酸盐依赖于氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）在好氧条件下氧化氨所提供。由于厌氧氨氧化过程受到氧气抑制，因此氨的好氧氧化和厌氧氧化之间存在微妙的氧平衡。前期的研究显示，氨和氧的亲和性在AOA/AOB竞争中起着至关重要的作用，同时也与AnAOB生态位分化关系密切，然而其对AOA/AOB与AnAOB在不同环境中的合作关系亦仍有待阐释。

本研究使用了三株AOA菌株，分别来自美国俄亥俄州的Delaware湖(DW)和Acton湖(AC2)的富集物，以及从土壤中分离出的纯培养物（Nitrososphaera viennensis），所有试验菌株均属于Thaumarchaeota Group I.1a分支。基于氨单加氧酶基因（amoA）序列比较分析，AC2与DW的同源性为82%，N. viennensis与AC2和DW富集物的同源性分别为 70%和 71%。荷兰鹿特丹Sluisjesdijk污水处理厂提供了AnAOB颗粒污泥，该颗粒污泥是从Anammox反应器中进行收集，其Anammox的优势菌为Brocadia anammoxidans。所有培养物均在30℃条件下，在含有1mM 或2mM NH4Cl的Crenarchaeota培养基中生长。在N. viennensis的培养基中添加1mM 丙酮酸盐，在AnAOB培养基中添加1.3mM 或2.0mM NaNO2。
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结果

  B4 {% c% b% w5 I; I" }1 ~DW AOA富集物的μmax、km,NH4、km,O2的结果如图1所示，AnAOB富集物的μmax、ki,O2的结果如图2所示。为了实现AOA和AnAOB之间的合作，需要与氧气（促进AOA /AOB和抑制AnAOB）和氨（供应给AOA /AOB和AnAOB）保持平衡。我们讨论了这种合作的两种可能情况：1. 微量需氧条件，当氧气浓度正好处于AOA活性被促进，同时AnAOB活性被抑制；2. 空间分离，即AOA/AOB产生的亚硝酸盐从好氧环境扩散到缺氧环境供AnAOB消耗利用。
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图1  DW AOA富集物的μmax、km,NH4、km,O2结果。图A为最大比生长速率(μmax; d−1)；图B为氨的半饱和常数(km,NH4; mM)；图C为氧的半饱和常数 (km,O2;mM)。利用亚硝酸盐的产生量确定图A的μmax (μmax= 0.41 d-1)，耗氧量确定图B和图C的km(km,NH4=0.77μM; km,O2=3.6μM)。



图2  AnAOB富集物的μmax、ki,O2结果。图A为最大比生长速率(μmax; d−1)；图B为氧的抑制常数(ki,O2; mM)。利用亚硝酸盐的消耗量确定图A的μmax (μmax= 0.15d-1)，用气体产量随压力的变化来确定图B的ki,O2(ki,O2=0.12μM)。

9 q* o4 }* G9 W3 s5 ?与促进AOA和AnAOB生长的氨相反，氧抑制AnAOB并促进AOA的生长。因此，存在某一浓度的氧气，可以抑制AnAOB的活性同时促进AOA生长。图3为AOA的氧亲和力曲线（以μmax和km,O2）和AnAOB氧抑制曲线（以μmax和ki,O2），曲线的交点表示AOA以相同的速率生产亚硝酸盐，同时AnAOB正以同样速率消耗。


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) o, r0 g  l- d图3  AOA平均氧亲和力曲线 (μmax= 0.36 d-1; km,O2=2.9μM)和AnAOB平均氧抑制曲线(μmax= 0.16 d-1; ki,O2=0.092μM)在0.32μM处有理想配合点（交点）。
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. b/ \# }; b8 v; _4 e$ M% a/ z. @另外，当AOA产生的亚硝酸盐从好氧环境扩散到缺氧环境时，空间分离可以实现协同。为了说明好氧氨氧化和厌氧氨氧化的分离，图4显示了从同侧（共扩散）和相反侧（反扩散）供应氧气和氨的生物膜模拟结果。
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3 z" k2 c% a6 X+ q  h9 `1 {图4  利用Aquasim软件建模比较对共扩散生物膜（左）和反扩散生物膜（右）通过短程硝化-厌氧氨氧化去除氨。AOB控制共扩散生物膜，而AOA控制反扩散生物膜。

; @$ G+ k0 K0 I( O2 e; }! Z0 T3 X讨论
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) k4 j5 P6 e% _2 \/ v/ _. g4 `1  AOA动力学
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" e9 N; _5 R) g: n本研究中的三株AOA菌株均具有大致相同的km,NH4和km,O2。km,NH4与先前报道的农田土壤中AOA富集物（km,NH4=0.69±0.04μM）相似，其中，主要AOA菌株为Candidatus Nirosoarchaeum koreensis MY1，与本试验中AC2的同源性为99.8%，与DW的同源性为81%。然而，本研究菌株的km,O2（km,O2≈2.9μM）高于MY1（km,O2=10.38±1.08μM）。这些结果进一步证实了AOA对氨的亲和力高于AOB（km,NH4范围为20~2000μM）。上述AOA中的km,NH4与报道的全程硝化（Comammox）菌的亲和性相当，然而同一篇文章报道的N.Vienensis的km,NH4明显高于我们的研究结果。从动力学的角度来看，Comammox和AOA应该竞争铵，未来的研究需要加强我们对其生态位分化的理解。
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1 s) M& ]& ]  m) F7 m7 P, U    AOA富集物的μmax与French等（2012）测量值相似（≈0.38 d−1）。虽然两种富集物的测量μmax相近，但对于N.viennensis，其最大比生长速率明显较慢。一个可能的原因是，N.viennensis的最佳温度为35-37℃，而这些表征在30℃下进行。Tourna等（2011）也报道了N. viennensis的富集物生长良好，但纯培养物仅在添加丙酮酸时才生长。虽然本研究中的N.viennensis培养实验中添加了丙酮酸，但由于与其他微生物在浓缩培养中生长时消耗或供应的因素，丙酮酸仍然是有限的（与两种浓缩培养相比）。因此，考虑到所有三种AOA的其他测量参数具有高度相似性，N.viennensis的μmax可能更接近本研究中表征的DW和AC2菌株的μmax。

虽然亲和性表征在确定生态位分化方面非常有用，但它不能作为绝对决定因素。如我们所示，参数测定存在变异性，其他环境条件，如温度、pH和群落因素在表观动力学参数中亦具有重要影响。AOA对氨的极强亲和性以及一些在酸性pH下生长的能力（其中铵是主要种类），已经推测它们的底物是铵而非氨。尽管最近的模型表明，大多数AOA的典型带电S层可以在氨氧化活性部位附近起到浓缩铵的作用，但目前还没有直接证据表明这两种物质都是底物。

7 R/ W/ o0 M- P) w( Y2  AnAOB动力学

6 _& S! e6 u3 r  w1 M4 sAnAOB的测量参数的重复之间的变异性通常高于AOA，这可能是由于以下原因：1. 相对不精确的活性测量；2. 由于AnAOB的聚集生长而增加的变异性；3. 群落复杂程度更高。尽管AnAOB颗粒污泥被分解，但是所得细胞倾向于再次絮凝/聚集并且更快地沉降，这可能导致培养物中的扩散限制。测量的亲和性与一些报道的值类似，其他研究报道氨和亚硝酸盐的亲和性更高。可能的解释是生态位分化与AnAOB菌株之间的亲和性差异有关。这种富集来自于一个污水处理厂，它接受非常高浓度的氨和亚硝酸盐，这可能选择了一个r-策略群体。相比之下，AnAOB在在寡营养环境中是活跃的，例如在海洋的缺氧区，将被认为采取具有更高亲和性的k-策略。尽管如此，AnAOB对氧的耐受性还是有限的，这表明在微嗜氧条件下其具有潜在的活性。文献报道μmax在30°C范围为0.0038 ~0.33 d−1，本研究结果同样处于这一范围内。类似于亲和性，不同AnAOB菌株μmax将根据他们所处环境的不同而有所不同。
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$ C6 ?1 s( I2 I% F. x3 AnAOB与AOA/AOB的竞争/合作与数学建模

" Q3 S; l, O3 j$ c7 S在评估AnAOB和AOA对氨的竞争时，很明显本研究中的AOA具有更高的亲和性。AOA的km值比报道的AnAOB的km值要低一个数量级。因此，在以氨为生长限制底物的寡养环境中，AOA很容易在氨的竞争中胜过AnAOB。另一方面，这些AOA和AnAOB之间的合作取决于AOA中的亚硝酸盐的产生和供应给AnAOB的未被AOA消耗的氨。因此，AOA对氨的氧化需要是部分的，产生亚硝酸盐但不消耗所有的氨。可以通过限制系统可用的氧气（图3）或通过AnAOB和AOA空间分离来促使这种合作（图4）。在氧饱和条件下，亚硝酸盐氧化细菌（NOB）将在亚硝酸盐的竞争中超过Anammox，但是这项研究将重点放在氧气限制的环境（例如海洋中的氧气最小区域），因此NOB没有被纳入到数学模型中。
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: T  B0 e) W- k  H5 F) T( _在生物膜环境中可能发生空间分离，例如在废水处理中，AOB消耗表面的氧和氨，而过量的氨和亚硝酸盐从AOB扩散到生物膜的低缺氧区域以供AnAOB消耗。然而，这取决于氨的供给量超过氧气，因此不会产生过量的亚硝酸盐。在营养浓度更低的环境中，这些生物膜将有利于AOA(或N. inopinata，显示出类似的高亲和力)超过AOB，但氧气需求将被显著限制，以允许氨扩散到AnAOB。另一方面，如果在生物膜的厌氧/缺氧侧提供氨，则AnAOB将优先获得氨。这就导致了这样一种情况，即AnAOB被提供更高浓度的氨，同时被氧气屏蔽并受亚硝酸盐限制，而AOA有更高浓度的氧气和有限浓度的氨，非常适合与AOB竞争。在传统的生物膜中，AOB/AOA是受氧气限制的。这种“交叉扩散”生物膜可以在AOA和Anammox之间形成类似于图3所示的微嗜氧环境更自然的协同作用。

& a2 a- l5 j& G: Y" _从模拟结果来看，AOB在共扩散生物膜中占优势，而由于AnAOB产生的氨限制，较高亲和力AOA在反扩散生物膜中占主导地位。虽然可以模拟在共扩散情况下与AOA的协同作用，但通过对氨的限制，限制氨到达缺氧的AnAOB层，因此需要对氧和氨进行严格的调整，以适应这种协同作用。
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* G6 Z8 [8 A- B. x尽管反扩散生物膜对全球氮循环可能并不重要，但在海洋水柱的大区域内也会出现类似的反扩散情况。以Lam等（2007）报道的黑海为例，氧从含氧地表水中向下扩散，而氨则从缺氧的底层海洋中从腐烂副产物向上扩散。这导致更深的海洋中表现出更高浓度的氨和更低浓度的氧水平，更有利于AnAOB；并且在上层海洋中有更低浓度和更高浓度的氧水平，对AOA更有利。淡水环境中存在相似的浓度梯度，表现出相似的种群响应，作者将这些环境中的合作归因于氧和氨的反扩散。由于低能脱氮的潜力，将Anammox系统应用于主流废水处理也是一个有意义的话题，然而实现低氮排放是一个挑战。已有的分析表明，在低氨浓度下，AOA富集应比AOB更有效，但是如果AOA和AnAOB存在于生物膜中，最理想的方案是提供氧气和氨反向扩散，以允许ANAOB活性（例如膜生物膜反应器）；然而，普通的生物膜反应器（颗粒污泥基或移动床生物膜反应器）更难以控制。

结论

& {9 J8 `( Z; F# W) Z, f本研究中的亲和性结果与已发表的AOA和ANAOB的km/i值基本一致。然而，尚未确定的是亲和性对AOA/AnAOB合作的影响。由于AOA具有很高的亲和力，作者认为正是氧/氨反扩散环境促进了AOA/AnAOB的合作。为了进一步证明这一点，可以尝试在膜生物膜反应器中生长AOA和AnAOB，或者可以对短程硝化-厌氧氨氧化共存的环境中进行群落调查。此外，AOA和AnAOB的种类很多，其动力学尚未被充分研究，此项工作仍具有十分重要意义。


原名：Affinity informs environmental cooperation between ammonia-oxidizing archaea (AOA) and anaerobic ammonia-oxidizing (Anammox) bacteria
: q. N7 u  I5 M5 Y# ~. I, }$ ]期刊：The ISME Journal，通信作者：Levi L. Straka
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